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光學顯微鏡

光學顯微鏡的優勢與限制:為何電子顯微鏡成為科學界的新寵

勀傑科技 整理

所謂光學顯微鏡,就是一種透過目鏡進行觀察的大倍率放大儀器,在科學、醫學、教育等領域,光學顯微鏡被廣泛應用並為人們揭示了許多奧秘。

何謂光學顯微鏡?

其基本工作邏輯是基於光學透鏡的放大原理,光線通過物體後會被聚焦到鏡片上,並通過物鏡(objective lens)進行第一次放大。

物鏡通常具有高度放大倍率和高解析度,可以顯示出物體細微的細節。接著,這些放大的光線通過目鏡(eyepiece)進一步放大,使觀察者能夠清晰地看到樣本。目鏡通常具有固定的放大倍率以提供舒適的觀察體驗。

光學顯微鏡的觀測最大倍率取決於鏡頭的設計和所使用的透鏡。一般而言,傳統光學顯微鏡的最大倍率通常在1000倍左右。

當然,隨著物徑口徑的增加,放大倍率還是可以繼續增大,但因為受到繞射的影響,解析力會變差,因此在倍率跟解析的兩相權衡之下,光學顯微鏡的極限大約在1600倍左右,如果想要更高的放大倍率,就會需要使用到電子顯微鏡。

光學顯微鏡 vs. 電子顯微鏡

光學顯微鏡的構造與應用

複式顯微鏡
(光學顯微鏡有許多類別,以上為最常見的複式顯微鏡。)

光學顯微鏡的構造

  1. 物鏡(Objective Lens):物鏡是位於光學顯微鏡筒的近物鏡筒上的鏡頭。它負責收集和聚焦從樣本發出或反射的光線,形成一個放大的實像。物鏡通常具有不同的放大倍率和數值孔徑,可選擇不同的物鏡來達到所需的放大倍率和解析度。

  2. 目鏡(Eyepiece):目鏡位於物鏡筒的近物鏡筒後方,觀察者通過目鏡來直接觀察放大後的影像。目鏡的放大倍率通常為10倍,但也有其他倍率可供選擇。

  3. 照明系統(Illumination System):照明系統用於照亮樣本,使其能夠發出或反射足夠的光線以進行觀察。光源可以是白熾燈、鎢絲燈、LED等,它們提供照明所需的光線。濾光片通常用於過濾照明光線,以消除不必要的波長或增強對比度。聚光系統則用於將光束集中到樣本上,提供足夠的照明強度。

  4. 載物台(Stage):樣本台是放置樣本的平台,通常具有可調節的XY移動功能,以便在觀察時對樣本位置進行微調。樣本台還可以具有樣本固定夾具或滑動機制,以確保樣本的穩定性。

  5. 依照成像方式的不同,又可以分為反射式顯微鏡與折射式顯微鏡。依照成像是否倒立,可分為倒立顯微鏡與解剖顯微鏡。

光學顯微鏡的應用

因為使用可視光和玻璃鏡頭對物體進行觀察和放大,光學顯微鏡經常被用於觀察微生物、動植物細胞等有機體,因此也被稱為生物顯微鏡。

光學顯微鏡的侷限

一般來說,裸眼能夠辨識的最小距離約為0.1毫米,相當於一根頭髮的厚度。這是因為人眼對於物體之間的分辨能力有限。光學顯微鏡能夠辨識的最小距離為200奈米(nm),比裸眼還要細微得多。

只是光學顯微鏡本身在使用上也有一些侷限:

  1. 需要多台顯微鏡:不同的應用可能需要使用不同類型的光學顯微鏡。例如,觀察細胞和組織的生物顯微鏡與觀察材料結構的金相顯微鏡有所不同。因此,根據需求,可能需要擁有多台不同類型的顯微鏡。

  2. 觀察距離短:光學顯微鏡的觀察距離通常較短,即目標物需要靠近物鏡才能進行觀察。這意味著在觀察大型物體或需要進行操作的場合,可能需要額外的操作空間。

  3. 薄樣本需固定在載玻片上:光學顯微鏡觀察薄樣本時,需要將樣本固定在載玻片上。這可能需要一些準備工作,例如切片和染色,以便在顯微鏡下進行觀察。

  4. 景深較淺:光學顯微鏡的景深(即在焦平面前後能夠保持清晰的距離)相對較淺。這對於觀察表面不平整的目標物可能帶來困難,因為只有焦平面上的區域會呈現清晰影像。

  5. 難以捕獲高解析度影像:光學顯微鏡需要搭載相機來捕獲影像。然而,由於光學顯微鏡受到繞射極限的限制,高解析度的影像捕獲可能會受到限制。

  6. 缺乏量測功能:一般光學顯微鏡通常不配備內建的量測功能。要進行精確的尺寸和距離測量,可能需要使用額外的量測工具。

此外,因為光學顯微鏡本身的限制,如果需要觀察更細小的東西,通常需要使用到掃描式電子顯微鏡(Scanning Electron Microscope)。

電子顯微鏡利用電子束而不是光線來成像,能夠觀察比光學顯微鏡更小的物體,一般適用於觀察奈米尺度的結構。電子顯微鏡具有非常高的解析度,能夠辨識到更小的特徵和細節,因此在奈米級觀察和材料研究方面具有重要的應用價值。

光學顯微鏡成像限制
資料來源:https://zh.wikipedia.org/zh-tw/File:LightLTSEM.jpg

光學顯微鏡有哪些種類?

光學顯微鏡有多種分類方法:

  • 按光學顯微鏡成像的過程和構造的複雜性,可分為解剖顯微鏡和複式顯微鏡

  • 按使用目鏡的數目可分為雙目和單目顯微鏡

  • 按圖像是否有立體感可分為立體視覺和非立體視覺顯微鏡

  • 按觀察對像可分為生物和金相顯微鏡等;

  • 按光學原理可分為偏光、相襯和微差干涉對比顯微鏡等;

  • 按光源類型可分為普通光、螢光、紫外光、紅外光和激光顯微鏡等;

  • 按接收器類型可分為目視、數位(攝像)顯微鏡

以下為幾種比較常見的光學顯微鏡:

種類簡介功能應用侷限
立體顯微鏡
Stereo Microscope
也稱為剖面顯微鏡或放大鏡,具有兩個物鏡系統,提供立體觀察的能力。提供立體影像,使觀察者能夠感知目標物體的深度和形狀觀察和研究不同尺度的生物和材料樣本放大倍率通常較低,不適用於需要高倍率觀察的微觀結構
工具顯微鏡Toolmaker’s Microscope高精度的測量顯微鏡,用於進行精確的尺寸測量和表面檢查配備了測量尺、十字線和照明系統等功能,可用於檢測微小物體的形狀、輪廓和表面特徵主要應用於製造業、精密工程和精密加工領域,例如鐘錶製造、珠寶製造、模具製造等低放大倍率和有限解析度、適合觀察大型和粗略的樣本
生物顯微鏡
Biological Microscope
通常用於生物學研究和醫學診斷具有中低倍率的放大能力,並搭配適當的照明和鏡頭系統,使得觀察者能夠觀察和分析生物組織、細胞、細菌和其他微生物觀察和研究生物體的結構、功能和相互作用限制於觀察生物樣本、對非生物材料的觀察有限
複合顯微鏡Compound Microscope結合了物鏡和目鏡的複合光學系統,具有高倍率的放大能力和較高的解析度和對比度具有多個物鏡和目鏡選擇,可實現不同放大倍率用於觀察和研究微觀結構、細胞、組織和材料的特徵對透明樣本的觀察受限、需要特殊技術處理
高倍顯微鏡
High-Power Microscope
具有較高放大倍率的顯微鏡配備多個高倍率的物鏡和目鏡,使觀察者能夠觀察微小的細胞、組織、微生物和其他微觀結構細胞觀察、組織分析、細胞培養、生物醫學研究和材料分析等方面都具有重要的應用價值侷限於高倍率觀察、對於全景觀察和大範圍的樣本可能不適用
光顯微鏡
Light Microscope
使用可見光進行觀察的顯微鏡,是最常見且基本的顯微鏡類型使用透射方式,將光通過樣本,然後通過物鏡進行放大和成像用於觀察生物樣本、組織切片、細胞培養試驗、材料分析和品質控制等解析度受到繞射限制、觀察非透明樣本受到限制
倒立顯微鏡
Inverted Microscope
光學系統的配置與傳統顯微鏡相比是倒置的主要用於觀察液態樣本或固定在培養皿中的生物樣本,因其特殊的配置,可以提供更大的操作空間和觀察深度用於觀察活細胞、細胞培養試驗、組織切片等觀察深度受限、不適合觀察厚樣本
金相顯微鏡Metallographic Microscope專門用於觀察金屬材料的顯微鏡有多個物鏡和目鏡選擇,可實現不同放大倍率。它還搭配了特殊的照明和成像系統,使觀察者能夠清晰地觀察和分析金屬材料的結構特徵金屬材料的研究、品質控制和失敗分析限制於金屬材料的觀察、對非金屬樣本的應用有限

從毫米、微米、到奈米:為何電子顯微鏡成為科學界的新寵

傳統光學顯微鏡的解析度受到繞射極限的限制,最多只能分辨到約200奈米的尺度。這意味著任何小於這個尺度的物體都無法在光學顯微鏡中清晰分辨出來。

由於人眼可見光的波長約在400至700奈米之間,因此以最小波長來算,也就是200奈米,這就是光學顯微鏡的極限。

然而,許多病毒、蛋白質等微觀物質的尺寸多數小於200奈米,因此無法直接透過傳統光學顯微鏡來觀察它們的細節,這時就需要依賴電子顯微鏡,利用電子束而非光束來進行觀察。

由上可知,電子顯微鏡(Electron Microscope)之所以成為科學界的新寵,主要是因為它具有以下優勢:

極高的解析度:電子顯微鏡使用的是電子束而不是光束,電子具有比光子更短的波長,因此能夠提供極高的解析度。相比光學顯微鏡的解析度通常在數百奈米至數微米之間,電子顯微鏡的解析度可以達到奈米級別。這使得科學家可以觀察並研究更小的結構和細節。

高放大倍率:電子顯微鏡能夠提供非常高的放大倍率,通常可達到數千至數百萬倍。這使得科學家能夠對微小結構進行更詳細的觀察和研究,例如細胞結構、細菌、奈米材料等。舉例:勀傑代理的Thermo Fisher桌上型電子顯微鏡,放大倍率就可達 200倍 ~ 2,000,000倍。

物理和化學分析能力:電子顯微鏡不僅可以提供高解析度的影像,還可以進行不同的分析技術,如能譜分析(EDS)、纖維統計分析 (Fiber Analysis) 、粒徑分析(Particle size analysis)。這些技術可以用於分析樣本的化學成分、結晶結構、元素分析線面掃描、3D粗糙度重建、纖維統計分析等。

光學顯微鏡 vs. 電子顯微鏡

光學顯微鏡電子顯微鏡

事實上,這兩者雖然都叫做顯微鏡,也同樣是為了微觀而製造的儀器,但其實這兩者還是有一些差異的:

光學顯微鏡電子顯微鏡
解剖顯微鏡複式顯微鏡掃描式
(SEM)
穿透式
(TEM)
原理使用可見光進行成像使用電子束進行成像
解析度受到繞射極限限制,最多約200奈米的分辨能力具有更高的解析度,可達到奈米等級的分辨能力
放大倍率數十倍10~2000倍數萬倍-百萬倍數十萬~數百萬倍
使用優點解剖生物,具立體感解像力較解剖顯微鏡大,使用比較普遍不需要切片可觀察物體表面,具立體感倍率及解像力最大
解像力最小0.2微米3奈米0.5奈米
樣本準備較為簡單,樣本可直接放置在顯微鏡下觀察樣本需要進行複雜的製備和處理,如嵌入、金屬蒸鍍等
應用範圍適用於觀察生物細胞、組織和大部分固體材料適用於觀察微觀結構、細胞內部、奈米材料和無機物質等
成本相對較低,設備較易維護和操作較高,設備複雜且昂貴,需要專業操作和維護
實時觀察可以實時觀察和即時影像擷取影像擷取需要複雜的程序和長時間曝光
樣本破壞通常不會對樣本造成明顯損傷此外電子束可能通過碰撞和加熱破壞樣本
影像分辨率較低,影像質量受限於光的散射和折射較高,能夠獲得更高清晰度和細節的影像

電子顯微鏡的高解析度使得科學家能夠研究更細微的結構、觀察細胞內部的細節以及探索奈米尺度的材料特性。此外,電子顯微鏡也能提供更高的放大倍率,使得微觀世界更清晰可見。

然而,值得注意的是,電子顯微鏡也有一些限制,例如樣本的製備較為複雜,需要特殊的處理和固定步驟。需要有一定專業的操作人員,以及相應的研究空間等等。

我該購買光學顯微鏡,還是電子顯微鏡?

光學顯微鏡和電子顯微鏡在檢測上其實是可以相輔相成的,各有不同的應用領域。假如以放大倍率為主要訴求,且觀察需求跨越微米和奈米尺度時,可以考慮直接購買一台高解析度的電子顯微鏡。

電子顯微鏡具有極高的放大倍率解析度,能夠觀察到細微的結構和奈米尺度的物體,並提供出色的細節和清晰度。對於需要進一步了解物體的細微結構、細胞內部的細節以及觀察奈米材料特性的研究,電子顯微鏡是無可替代的工具。

然而,光學顯微鏡也有其獨特的優勢。光學顯微鏡操作簡單,成本較低,且無需對樣品進行複雜的前處理。它可以觀察到一定放大倍率的物體,並且對於生物樣本的觀察非常有用,因為它不會對樣本造成傷害。此外,光學顯微鏡還能夠實時觀察樣品並捕獲高解析度的影像,方便進行即時分析和觀察。

因此,當觀察需求跨越微米和奈米尺度時(光學顯微鏡最大倍率1600倍,電子顯微鏡可從200倍~200萬倍),考慮購買一台高解析度的電子顯微鏡是一個合理的選擇。這樣可以獲得更廣泛的觀察範圍,同時兼具高解析度和實時影像捕獲的能力,滿足不同尺度下的觀察需求。除了放大倍率的考量外,也必須評估待測樣品所需條件、是否有額外功能需求等,建議先找專業技術人員諮詢,以取得最有效的影像解決方案。

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